BỘ Y TẾ -----	CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -------
Số: 3348/2001/QĐ-BYT	Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2001

 

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH "THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM"

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ theo Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng,  nhiệm vụ, quyền hạn và  tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh Văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng Vụ Pháp chế, Chánh Thanh tra - Bộ Y tế và Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm,

QUYẾT ĐỊNH

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật định lượng Clostridium perfringens trong thực phẩm”.

Điều 2. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.

Điều 3. Các ông, bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng - Bộ Y tế; Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này.

 

KT. BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ THỨ TRƯỞNG Lê Văn Truyền

 

THƯỜNG QUY KỸ THUẬT

ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM  PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3348/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế )

I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP

Vi khuẩn C. perfringens (trong môi trường thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC))  trong điều kiện kỵ khí sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có màu đen. Chọn khuẩn lạc điển hình, xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Phát hiện ô nhiễm Clostridium perfringens trong nước, thực phẩm và thức ăn chế biến sẵn.

III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ

1. Dụng cụ, thiết bị

- Nồi cách thủy.

- Bình nuôi cấy kỵ khí.

- Pipet chia độ 1, 5, 10 ml.

2. Môi trường, thuốc thử

- Thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC agar).

- Môi trường Iron - Milk.

- Môi trường Lactoza gelatin.

- Canh thang gan cục hoặc canh thang thịt.

- Canh thang nuôi cấy nha bào.

- Dung dịch thioglycolat.

- Dung dịch đệm glycerin - salt.

- Nước muối đệm Pepton 9‰.

- Thuốc nhuộm Gram.

IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ

1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được pha chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110^oC/30 phút hoặc 121^oC/15 phút)

2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

2.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.

Lưu ý: Mẫu thực phẩm nếu xét nghiệm sau 8 giờ phải được bảo quản trong dung dịch muối đệm - glycerin (Buffer glycerin Salt Solution - BGS) bằng cách: ngâm thực phẩm trong dung dịch BGS theo tỷ lệ 1:1 và bảo quản trong điều kiện lạnh - 20^oC.

Trước khi xét nghiệm, phải làm tan băng.

2.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^-1

Cân chính xác 25 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho  vào bình nón chứa sẵn  225 ml nước muối đệm pepton (BPW) 9‰.

Lắc đều 2 - 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 10^-1

2.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^{- 2},10^{- 3},10^{- 4}...

- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10^-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối đệm pepton 9‰. Lắc đều trong 2-3phút. Thu được dung dịch 10^-2.

- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10^-3, 10^-4, 10^-5.... (theo sơ đồ ).

3. Phương pháp tiến hành

A. Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch

Bước 1: 

- Rót 6 - 7 ml thạch TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu nồng độ pha loãng. Lắc cho thạch láng đều mặt đĩa.

- Khi thạch đông chặt, lấy pippet hút chính xác 1 ml ở mỗi nồng độ pha loãng dung dịch mẫu thử nhỏ lên mặt thạch. Mỗi nồng độ cấy trong hai đĩa petri tương ứng.

- Rót tiếp 15 ml thạch TSC vào mỗi đĩa petri đã được láng mẫu thử.  Lắc trộn đều sao cho thạch phủ đều khắp bề mặt đĩa petri.

- Khi thạch đông chặt, lật ngược đĩa, đặt vào bình  kỵ khí (ví dụ các túi hóa chất tạo kỵ khí hoặc tủ ấm nuôi vi khuẩn kỵ khí).

Đặt bình kỵ khí vào tủ ấm 35⁰C/20 -24 giờ.

Bước 2:  Đọc kết quả sơ bộ sau 24 giờ

- Đếm toàn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, có màu đen..

- Tính số lượng vi khuẩn C. perfringens /1 g thực phẩm  bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng.

* Ghi chú :

- Chỉ đếm các đĩa thạch có khoảng 20 - 200 khuẩn lạc để tính kết quả.

- Nếu các khuẩn lạc phân bố trên đĩa nuôi cấy không rõ ràng thì phải làm lại.

Bước 3:  Xác định hình thể và tính chất bắt mầu

a) Chuẩn bị canh trùng thuần nhất

Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc điểm: tròn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen trên đĩa thạch TSC cấy vào 1 ống môi trường canh thang thioglycolat hoặc canh thang gan cục và canh thang nha bào.

Ủ ấm 35⁰C/18 - 24 giờ. Thu được canh trùng thuần nhất.

b) Hình thể và tính chất bắt mầu

- Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram để xem hình thể và tính chất bắt  mầu. C. perfringens là  trực khuẩn ngắn, bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr ( +).

- Phát hiện khả năng sinh nha bào: nhuộm Gram từ canh thang nha bào thấy: trực  khuẩn ngắn, tròn đầu, giữa có khoảng trắng sáng không bất mầu thuốc nhuộm.

Bước 4:  Thử tính chất sinh vật hoá học

a) Thử nghiệm Iron - Milk

- Lấy 1ml canh trùng thuần nhất cho vào ống nghiệm  môi trường Iron - Milk

- Đun cách thuỷ 46^oC/2giờ.

- C.perfringen làm đông sữa nhanh ở đáy ống nghiệm và tạo ra lớp nhũ tương ở trên.

b) Thử tính chất lên men đường và hoá lỏng gelatin

- Từ canh trùng thuần nhất cấy vào môi trường lactoza gelatin. Sau 24 giờ ở 35⁰C , nhận định  khả năng lên men đường Lactoza, và khả năng sinh hơi. Đặt ống nghiệm vào 5⁰C/1 giờ - Đọc kết quả sơ bộ khả năng hóa lỏng gelatin..

- Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc, ủ thêm 24 giờ/ 35⁰C.

c) Khả năng chuyển hoá nitrat thành nitrit:

- Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35^oC/24 giờ. Nhỏ 0,25ml thuốc thử A và B.

- Quan sát mầu môi trường chuyển sang mầu cam hoặc tím (+)/10 phút.

Tiêu chuẩn để xác định C. perfringen

Trực khuẩn ngắn: Gr   (+)	Có nha bào	Khuẩn lạc mầu đen trên TSC
Nitrit: (+)	Lactoza: (+)	Hơi: (+)
Iron-milk: (+)	Gelatin: (+)

 

B. Phương pháp nuôi cấy trong ống thạch

B.1. Môi trường thuốc thử

- Thạch Wilson Blair hay thạch Perfringens selective được đổ vào mỗi ống nghiệm ( mỗi ống nghiệm khoảng 30ml thạch)

- Dung dịch natri sunfit 20%.

- Dung dịch ferrous amon sunfat 5% (dung dịch phèn sắt 5%).

B.2. Tiến hành

- Chuẩn bị mẫu và dung dịch  mẫu thử như trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn của mẫu mà pha loãng đến đậm độ dùng nuôi cấy.

- Đun chảy thạch Wilson Blair hoặc thạch Perfringens selective, để nguội khoảng 50⁰C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử. Mỗi nồng độ cấy trong 2 ống. Mỗi ống cho thêm 2ml dung dịch Na₂SO₃ 20% và 5giọt phèn sắt 5%. Lắc trộn đều.

- Đun cách thủy 75⁰C/15phút. Làm đông nhanh thạch.

- Để 37⁰C/18-24h.

B.3. Đọc kết quả:  Khuẩn lạc vi khuẩn C. perfringens tròn, đen, có đường kính ³ 3mm.

V. TÍNH KẾT QUẢ

Tính  số vi khuẩn có trong 1g mẫu bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc  nghi ngờ C. perfringens có trong hai đĩa thạch hoặc ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng độ nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.

Ví dụ:  Độ pha loãng 10^-2 :         

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc

- Số khuẩn lạc có trong 1g thực phẩm được tính

X =	10 + 14	x 100 = 120
	2 x 10

 

Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm có 1,2 ´ 10 ² vi khuẩn C.perfringens

 

Sơ đồ định lượng C. perfringens

1. Đồng nhất mẫu

Thạch Tryptose – Sunfit – Cycloserin (TSC)

3. Đổ thạch

4. Ủ ấm

Bình kỵ khí để trong điều kiện 35⁰C/20-24 giờ

5. Nhận định kết quả sơ bộ: Chọn đĩa có 20-200 khuẩn lạc đen để đếm

6. Xác định hình thể, tính chất bắt mầu và khả năng sinh nha bào

7. Xác định tính chất sinh vật hoá học

Trực khuẩn ngắn            Có nha bào                        Mầu đen trên môi trường TSC

Lactoza: (+)                   Hơi: (+)                 Iron – milk: (+)        Làm lỏng gelatin

 

PHỤ LỤC

MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ DÙNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG C. PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM

1. Thạch Tryptose - Sulfide - Cycloserine (TSC agar)

Tryptose (Difco)	15g
Men thủy phân	5g
Soyton	5g
Sắt ammonium citrat	1g
Natri metabisunfit	1g
Agar	20g
Nước cất	900ml

- Đun tan môi trường TSC.

- pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 121⁰C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở 50⁰C.

- Dung dịch D-cycloserine : Pha 1gam D-cycloserin (tinh thể trắng) vào 200ml nước cất. Khử trùng bằng cách lọc và bảo quản 4⁰C trước khi dùng.

- Khi dùng : cho 20 ml dung dịch D-cycloserin vào 250 ml thạch nêu trên. Trộn đều đổ đĩa.

Trong trường hợp cần thạch TSC có lòng đỏ trứng gà, sau khi cho D-cycloserin vào, cho thêm 20 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều đổ đĩa trước khi dùng.

2. Canh thang thyoglycolat

L.cystin	0,5g
Agar	0,75 g
NaCl	2,5 g
Dextroza	5 g
Men thủy phân	5 g
Trypton	15 g
Natri thioglycolat hoặc axit thioglycolat	0,5g
Resazurin natri solution(1:1000) mới pha	1ml
Nước cất	1 lít

Pha L- cystin, NaCl, dextroza, men thủy phân và tryptose trong 1 lít nước. Đun cách thủy cho tan. Pha thêm natri thioglycolat hoặc axit thioglycolic, pH = 7,1 ± 0,2. Cho thêm dung dịch Natri resazurin, trộn rồi hấp ướt 121⁰C/20 phút. Có thể san ra các ống nghiệm trước khi sấy ướt.

2. Môi trường Iron - Milk cải tiến

Sữa tươi toàn phần	1 lít
Sắt sunfat.7H2O	1 g
Nước cất	50ml

Hòa sắt sunfat vào trong 50 ml nước cất. Cho từ từ 1 lít sữa, vừa cho vừa quấy đều bằng máy khuấy từ (hoặc bằng đũa thủy tinh). Hút 11ml môi trường vào ống nghiệm 16 x 150 mm. Hấp ướt 118⁰C/15 phút. Môi trường này pha chế nên sử dụng ngay.

4. Môi trường lactoza - gelatin   

Tryptose	15g
Men thủy phân	10g
Lactoza	10g
Đỏ phenol	0,05 g
Gelatin	120g
Nước cất	1 lít

Đun cho tan Tryptose, men thủy phân và lactoza trong 400ml nước. Hòa tan gelatin trong 600ml nước nóng 50 - 60⁰C cho tan. Trộn 2 hỗn dịch trên lại, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2. Cho thêm chỉ thị màu đỏ phenol. San ra các ống nghiệm 16 x 150mm. Hấp ướt ở 121⁰C/10phút. Trong vòng 8 giờ nếu chưa dùng cần để nóng 50 - 70⁰C/ 2 - 3 giờ trước khi tiến hành xét nghiệm.

5. Môi trường canh thang bào tử (Sporulation broth)

Polypepton	15g
Men thủy phân	3 g
Starch, soluble	3 g
MgSO4 khan	0,1g
Natri thioglycolat	1 g
Na2HPO4	11g
Nước cất	1lít

Chỉnh pH 7,8 ± 0,1. San ra các ống nghiệm. Hấp ướt 121⁰C/15 phút.

6. Môi trường di động nitrat

Cao thịt bò	3 g
Pepton (Difco)	5 g
KNO3	1 g
Na2HPO4	2,5g
Thạch	3 g
Galactoza	5 g
Glycerin	5 ml
Nước cất	1 lít

Hòa các chất trên trừ thạch. Chỉnh pH 7,3 ± 0,1. Cho thêm thạch và đun đến khi tan. San ra các ống 11 ml. Hấp ướt 121⁰C/15 phút. Nếu trong vòng 4 giờ chưa sử dụng thì trước khi tiến hành xét nghiệm phải đun sôi cách thủy 10 phút, sau đó làm lạnh ngay bằng nước.

7. Dung dịch đệm glycerin muối

Glycerin	100ml
K2HPO4	12,4g
KH2PO4	4g
NaCl	4,2g
Nước cất	900ml

Hòa tan NaCl trong bình có 900ml nước cất. Cho glycerin và phosphat chỉnh pH=7,2. Hấp ướt 121⁰C/15phút. Trong trường hợp dùng dung dịch glycerin đậm đặc (20%) , cho 200ml glycerin trong 800ml nước cất.